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分享海馬神經(jīng)元原代培養的詳細操作步驟

更新時(shí)間:2022-12-08      點(diǎn)擊次數:1237
 海馬神經(jīng)元原代培養一般是將孕雌鼠麻醉然后解剖,胎兒收集到HBSS-1中然后快速斷頭。剝離腦膜和白質(zhì)后,大腦皮質(zhì)收集入HBSS-2液中機械磨碎。皮質(zhì)碎片移到有0.025%胰酶的HBSS-2液中37°C消化15分鐘。胰酶消化后,細胞用含有10%胎牛血清的HBSS-2液沖洗兩次,用神經(jīng)基礎培養液重懸細胞(培養液添加了0.5mM左旋-谷氨酰胺,25μM左旋-谷氨酸,2%B27和0.12mg/mL慶大霉素)。以1×105cell/cm2接種到事先用多聚賴(lài)氨酸包被的培養皿上,放到37°C,5%CO2濕溫培養箱里進(jìn)行培養。每3天用吸管換液,一次換0.5mL。體外培養8天細胞就能用于實(shí)驗。

海馬神經(jīng)元原代培養培養步驟(以海馬為例)
1、取胚胎期第18天(E18)的孕鼠(小鼠的cellculture可取P0-P1的新生鼠,冰上麻醉),用異氟烷混合氣體麻醉(注意:最好不要腹腔注射水合氯醛進(jìn)行麻醉,因為腹腔注射對胎鼠影響較大);  
2、在冰上迅速破腹取出胎鼠;  
3、將胎鼠的頭剪下放在冰的dissectionmedium里;  
4、剝去皮膚組織和顱骨,將大腦連接小腦一起取出放在另一個(gè)裝有冰的dissectionmedium的dish中;  
5、將dish放在冰上,將大腦分割成兩半,分割時(shí)在與小腦連接的腹側基部斷開(kāi),這樣便于暴露海馬;  
6、撥去腦膜,用小剪刀將海馬剪出。由于皮層細胞較多,此時(shí)可將接近小腦的那些皮層組織夾去(注意:不要用鑷子擠捏腦組織,這樣會(huì )造成大面積細胞死亡,不利于后續的培養);  
7、在dish中將組織用小剪刀減碎;  
8、吸取含有組織碎塊的dissectionmedium至5ul的epp管中;  
9、靜置一段時(shí)間,待組織碎塊沉降至底部后吸取上清(不需要吸的很干凈);  
10、在另一個(gè)5ml的epp管中按照trysin:DNA酶:digestionsolution=1:1:3的體積比混合,用過(guò)濾器過(guò)濾后加入組織塊中;  
11、在37度消化7-8分鐘,最長(cháng)不要超過(guò)15分鐘(消化時(shí)間根據酶的濃度確定),每2分鐘混勻一下;  
12、此時(shí)可以在5ml的epp管中準備trysininhibitor(TI):dissectionmedium=1:4的混合液(也可以用5%FBS+Neurobasal+B27代替),在預先coating的dish中加入一定量的5%FBS+Neurobasal+B27混合液;  
13、將消化的組織塊從37度中取出、離心,也可自然沉降,吸取上面多余的液體后,加入第12步的混合液中止消化,37度靜置2-3分鐘;  
14、以下步驟要求在冰上完成。靜置,待組織塊沉到底或者離心后,吸走上清液,然后加入DNA酶(可用dissectionmedium稀釋?zhuān)?,吹打?nbsp; 
15、離心5-6分鐘,吸走上清;  
16、加入2-3ml的dissectionmedium后,用移液器或者吸管將碎組織塊吹散;  
17、10倍稀釋后計數(10ul懸浮液+90ul臺盼藍);  
18、按照要求濃度鋪板,然后充分混勻;  
注意:一般一只小鼠的腦子可以取得2x10^7-3x10^7個(gè)神經(jīng)元,體外培養3-9天的神經(jīng)元均可以被慢病毒感染。
 

海馬神經(jīng)元原代培養

 

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