膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GramD1C調(diào)控自噬啟動(dòng)和線粒體生物能量學(xué)

文獻(xiàn)內(nèi)容講解

巨自噬（以下簡稱自噬）涉及膜的初始形成，將細(xì)胞質(zhì)中需要分解的物質(zhì)隔離形成雙膜自噬體，自噬體隨后與溶酶體接觸，進(jìn)而融合，從而使物質(zhì)分解和由此產(chǎn)生的大分子循環(huán)，以在饑餓和細(xì)胞應(yīng)激期間獲得穩(wěn)態(tài)。

自噬體的生物發(fā)生通過ULK1激酶復(fù)合物和III類磷脂酰肌醇3激酶復(fù)合物1(PIK3C3-C1)聚集到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)相關(guān)位點(diǎn)啟動(dòng)，新形成的自噬體即從這些位點(diǎn)發(fā)出。自噬體膜很大程度上缺乏跨膜蛋白，因此認(rèn)為其形成受膜相關(guān)蛋白及其脂質(zhì)組成和分布的調(diào)節(jié)。

前人研究表明，自噬體富含不飽和脂肪酸，而這些脂肪酸是自噬體形成所必需的。這些研究表明，降低膜序有利于自噬的啟動(dòng)，可能是通過產(chǎn)生已知的自噬體形成所需的柔性高度彎曲的膜。除了磷脂、膽固醇是哺乳動(dòng)物膜的一個(gè)重要組成部分，它的豐度也是膜秩序和流動(dòng)性的決定因素。

細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平通過生物發(fā)生和細(xì)胞外膽固醇攝取進(jìn)行雙重調(diào)節(jié)。除了低密度脂蛋白受體(LDLR)途徑外，一些膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白也被證明直接從質(zhì)膜(PM)介導(dǎo)膽固醇的輸入和胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。這種膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白例如 GramD 家族蛋白（由GramD1A、GramD1B、GramD1C（也稱為ASTER蛋白）、GramD2和GramD3)，以其N-末端區(qū)域的脂質(zhì)結(jié)合PH相似結(jié)構(gòu)域命名。在這5個(gè)成員中，只有GramD1A、GramD1B和GramD1C（這里統(tǒng)稱為GramD1S)含有一個(gè)與甾醇結(jié)合的巨大結(jié)構(gòu)域，允許它們促進(jìn)PM到ER膽固醇的輸入。

GramD1S的缺失導(dǎo)致細(xì)胞膜中可及膽固醇的積累,而GramD1A和GramD1B缺失的小鼠巨噬細(xì)胞也表現(xiàn)出甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2(SREBP2)靶基因的上調(diào)表達(dá)，表明ER膽固醇降低。由于對(duì)GramD家族蛋白質(zhì)的研究數(shù)量有限，它們的生物學(xué)重要性仍未深入了解。

膽固醇耗竭促進(jìn)自噬啟動(dòng)

此項(xiàng)研究用快速清除細(xì)胞膜中膽固醇的MBCD分析了膽固醇耗盡后饑餓誘導(dǎo)的自噬的短期影響。對(duì)照細(xì)胞相比，在基礎(chǔ)條件下，膽固醇耗竭導(dǎo)致LC3B(LC3B-II)的膜結(jié)合形式增加了三倍，這在缺乏膽固醇的饑餓細(xì)胞中進(jìn)一步增強(qiáng)；據(jù)內(nèi)源性LC3B點(diǎn)狀體的免疫熒光顯微鏡觀察，膽固醇耗竭增加了Fed和Starved細(xì)胞中自噬體的形成。這些結(jié)果表明，膽固醇耗竭促進(jìn)自噬誘導(dǎo)，并增強(qiáng)饑餓誘導(dǎo)的自噬。

為了闡明細(xì)胞膽固醇調(diào)節(jié)劑是否也影響自噬，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)耗竭在膜接觸點(diǎn)作為非泡狀細(xì)胞器間膽固醇運(yùn)動(dòng)中介的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。鑒于復(fù)合物通過其C端區(qū)域22和GramD1A參與自噬，為明確GramD1A家族的其他成員是否也參與自噬，用siRNA轉(zhuǎn)染穩(wěn)定誘導(dǎo)表達(dá)自噬報(bào)告基因Mcherry-EGFP-LC3B（黃色自噬體，由于酸性溶酶體中EGFP猝滅而產(chǎn)生的紅自溶酶體）的U2OS細(xì)胞，分別耗盡每個(gè)Gram家族成員。這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，GramD1C介導(dǎo)的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)饑餓誘導(dǎo)的自噬。

U2OS細(xì)胞中GramD1C耗竭導(dǎo)致了幾種早期自噬機(jī)制成分的增加，如ATG13、ATG16L1和PTDINs(3)P效應(yīng)蛋白WIPI2B40；而且與膽固醇耗竭細(xì)胞中的結(jié)果一致，研究發(fā)現(xiàn)GramD1C耗竭促進(jìn)饑餓細(xì)胞中EGFP-BAT的募集，這些結(jié)果提示GramD1C通過降低膜曲率抑制自噬體的啟動(dòng)。

為了研究GramD1C是否可能調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體之間的膽固醇運(yùn)動(dòng)，我們?cè)诜蛛x的線粒體中加入重組Mcherry標(biāo)記的perfringolysin O(Mcherry-D4)膽固醇結(jié)合域，建立了一種線粒體膽固醇定量方法。后續(xù)通過一系列實(shí)驗(yàn)證明GramD1C是線粒體膽固醇豐度和線粒體生物能量學(xué)的負(fù)調(diào)節(jié)因子。

Gram家族表達(dá)對(duì)CCRCC預(yù)后的影響

通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析腎透明細(xì)胞癌(KIRC)腫瘤基因表達(dá)數(shù)據(jù)中完整的Gram1C家族在CCRCC中的參與情況，及患者生存的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)GRAMD1C、GRAMD2B是腎透明細(xì)胞癌(CCRCC)患者預(yù)后的不利因素；Gram家族成員可能是通過調(diào)節(jié)新陳代謝和癌細(xì)胞存活率來調(diào)節(jié)CCRCC患者的總存活率。